De uitvinding van de geneditor CRISPR-Cas wordt een revolutie in de biologie genoemd. Wetenschappers beloven het te gebruiken om plantenrassen en dierenrassen voor de landbouw te verbeteren, om aangeboren genetische ziekten bij mensen te behandelen. De correspondent van RIA Novosti ging kijken wie en hoe het genoom wordt bewerkt.
Het Genome Editing Center van de Moscow State University opende iets meer dan een jaar geleden - op de campus. Ik word opgewacht door de directeur, doctor in de chemie Peter Sergiev, en terwijl we in de lift rijden, wijdt hij een beetje aan de geschiedenis van genetische manipulatie.
“Het genoom is al eerder bewerkt. Maar het was moeilijk om hiervoor tools te maken, het kostte veel tijd en het resultaat was vaak niet zoals we het wilden”, zegt hij.
In het vivarium verandert Pjotr Vladimirovitsj in blauwe laboratoriumkleding, ze geven me een witte wegwerpoverall en vragen me de camera met alcohol af te vegen. Nu ziet Petr Vladimirovich eruit als een chirurg, en ik - als een laboratoriumassistent uit de serie "CSI - Crime Scene".
In het steriele laboratorium is voor ons een container met bevruchte muizeneieren en een reageerbuisje met RNA-oplossing klaargemaakt. Dat is alles wat u nodig heeft voor CRISPR-Cas genoombewerking.
CRISPR is een Engels acroniem voor een uitdrukking die letterlijk betekent "regelmatig gegroepeerde korte palindrome herhalingen". In feite zijn dit slechts kleine stukjes DNA van bacteriofaagvirussen ingebed in het bacteriële genoom. Deze sequenties zijn nodig om het bacteriële immuunsysteem te laten functioneren en dienen als een soort "door de politie gezochte" aankondiging. Als de bacterie overleeft nadat hij is geïnfecteerd met een bacteriofaag, gebruikt hij de Cas-proteïne-enzymen om een stukje van zijn DNA te knippen en in zijn genoom in te brengen voor latere herkenning. Het bacteriële genoom erft deze bibliotheek van "vijanden" die zorgvuldig door vorige generaties zijn verzameld.
In 2013 ontdekten wetenschappers dat het Cas-eiwit in elk organisme werkt, inclusief zoogdieren. Hij is in staat om richtingbreuken te maken in beide strengen van het DNA-molecuul en zo het genoom te veranderen.
Promotie video:
Ei manipulatie
Petr Sergiev maakt een glazen capillair met een diameter van honderd micron bij de microsmederij, trekt het ei erin en brengt het onder glas met een voedingsmedium. Het voltooide monster wordt naar het podium van de optische microscoop gestuurd. De monitor geeft een vergroot beeld weer van het ei, dat trilt aan het uiteinde van het capillair. Twee afgeronde punten vallen op - dit zijn pronuclei met het DNA van de moeder en vader.
De wetenschapper bereidt nog een capillair voor met een grootteorde kleiner in diameter. Dit is een injectiespuit. Het verzamelt een oplossing met twee soorten RNA erin en doorboort met behulp van manipulatoren voorzichtig het ei. Dat is het, de injectie is klaar.
RNA dat in het ei wordt geïnjecteerd, is nodig om het genoom op een bepaalde locatie te snijden. Eén type RNA bevat een strikt gedefinieerde sequentie van nucleotiden, vergelijkbaar met degene die we wilden veranderen. De taak van dit RNA is om het overeenkomstige gebied in het DNA te vinden, daarom wordt het "gids" genoemd. RNA van het tweede type, matrix, is een soort instructie voor de synthese van het Cas9-nuclease-eiwit. Dit eiwit fungeert als een katalysator voor een chemische reactie die fosfodiësterbindingen verbreekt tussen goed gedefinieerde DNA-basen. Omdat het eiwitmolecuul twee nucleasecentra heeft, worden beide DNA-strengen geopend, bovendien op de plaats waarvan Cas9 de coördinaten "telde" met het gids-RNA.
Het DNA-molecuul ziet de breuk in beide strengen als een ernstige afbraak en probeert deze te herstellen. Exonuclease-enzymen die in de cel zweven, verwijderen onmiddellijk verschillende nucleotiden aan beide uiteinden van de breuk. Dit is genoeg om een gen te breken of, zoals genetici zeggen, "uit te schakelen".
Hoe de genomische editor van CRISPR-Cas9 werkt / Illustratie door RIA Novosti. Alina Polyanina.
Als een gerichte mutatie nodig is, is het bijvoorbeeld nodig om een eiwit te markeren om het in het lichaam te volgen, dan wordt een ander sjabloon aan het complex toegevoegd aan twee RNA's in de vorm van een speciaal ontworpen DNA. Het bestaat uit reeksen die identiek zijn aan de randen van de toekomstige onderbreking en bevat ook de in te voegen sectie. Nadat Cas9 het DNA-molecuul heeft doorgesneden, worden de uiteinden ervan verbonden met behulp van deze extra sjabloon, dus de set nucleotiden die we nodig hebben, wordt in de breuk ingevoegd.
“We kunnen een kleine staart aan de eekhoorn vastmaken, waardoor het handig is om hem eruit te trekken en te zien waarmee hij in wisselwerking staat. We kunnen een gen invoegen, maar het is niet zo effectief als het uitschakelen”, legt de wetenschapper uit.
GGO's en hersenschimmen
Het bewerkte ei wordt getransplanteerd in de baarmoederbuis van een surrogaatmuis. Ze woonde enige tijd samen met een man wiens seminiferale tubuli waren vastgebonden. Het stel had een normaal seksleven, maar kon niet zwanger worden. Niettemin geloofde het lichaam van de muis dat ze zwanger was, en vormde het de juiste hormonale achtergrond voor haar. Nu draagt dit vrouwtje de foetus van iemand anders.
Over drie weken zal ze de meest gewone muizen baren. Wetenschappers zullen wachten tot de knaagdieren opgroeien, een klein stukje van hun staart van ze afnemen en PCR gebruiken om het stukje DNA dat ze hebben bewerkt te analyseren. In meer dan de helft van de gevallen wordt een mutatie of een uitgeschakeld gen gevonden. De omgekeerde procedure - het inbrengen van een sequentie in het genoom - slaagt in niet meer dan 10% van de experimenten.
Bij het bewerken verschijnen er verschillende interessante effecten. Er worden bijvoorbeeld mozaïekmuizen of chimaera's geboren, die cellen hebben met verschillende variaties van het moeder- en vaderlijke genomen. Cas9 kan DNA vele malen knippen, maar het boodschapper-RNA dat ervoor codeert, is niet eeuwig en de geïnjecteerde oplossing verdwijnt gewoon in een reeks celdelingen. Soms vuurt de redacteur nog een keer nadat de pronuclei zijn versmolten en het ei is gedeeld. En aangezien DNA-reparatie na een breuk altijd een willekeurig proces is en genezing nooit op dezelfde manier plaatsvindt, zullen sommige cellen in het ene organisme een andere mutatie bevatten.
Voor wetenschap en geneeskunde
We gaan naar de aangrenzende kamer om de live resultaten van de experimenten met genoombewerking te bekijken. Op de planken aan de linkerkant - containers met genetisch gemodificeerde muizen, aan de rechterkant - met gewone knaagdieren ter bestrijding. Ze waren gekweekt, zoals die aan de linkerkant, maar het genoom werd niet gemanipuleerd. Controlemuizen zijn nodig om een norm voor onze ogen te hebben en de wezens die in het experiment zijn verkregen ermee te vergelijken.
Pyotr Sergiev pakt een van de containers met een paar grijze muizen. Uiterlijk zijn ze volkomen gewoon, maar ze hebben geen nakomelingen. Het feit is dat bij de man het gen van een van de RNA-methyltransferasen, een enzym dat alleen in sperma wordt geproduceerd, is uitgeschakeld. Mannetjes met een inactief gen worden steriel geboren. Het exacte doel van het gen en enzym is nog onbekend. Om erachter te komen, werden in het laboratorium twee muizenstammen gekweekt: bij de ene was een gen uitgeschakeld en bij de andere was een eiwit gemarkeerd met een genomische editor.
“Een mutatie in dit gen wordt ook bij mensen aangetroffen - dan lijdt een man aan onvruchtbaarheid. Maar totdat we erachter komen waarom het nodig is, waarom het RNA wijzigt, zullen we dergelijke patiënten niet kunnen helpen”, redeneert de wetenschapper.
In feite kennen we nog steeds niet de functie van de meeste menselijke genen. Hier achter komen is een fundamentele taak die door veel onderzoeksgroepen over de hele wereld wordt opgelost, ook in Rusland. Het genoom van de muis lijkt erg op dat van mensen. Hopelijk gaat met CRISPR-Cas de studie van het genoom van elk wezen sneller.
Sergiev's groep samen met N. N. NN Petrova ging op zoek naar mutaties die tot bepaalde soorten kanker leidden. De dichtstbijzijnde plannen omvatten een project om genetisch gemodificeerde dieren voor de landbouw te creëren in samenwerking met het All-Russian Research Institute of Animal Husbandry en het Institute of Gene Biology van de Russian Academy of Sciences.
“CRISPR-Cas is een fantastische tool waarmee je naar eigen inzicht het genoom kunt veranderen, om een beetje van God te zijn. Uiteindelijk is het de taak van de wetenschap om te begrijpen hoe zo'n complex wezen als een zoogdier werkt”, zegt de wetenschapper.
Het oplossen van fundamentele wetenschappelijke problemen is geweldig, maar wat levert deze technologie de geneeskunde op? Helaas niet veel in de nabije toekomst. Het is gemakkelijk om een ei te bewerken en een genetisch gemodificeerde muis groot te brengen, maar het is onmogelijk om de genen van een volwassen dier, laat staan een mens, te corrigeren.
Methoden voor het bewerken van DNA in somatische (dat wil zeggen, reeds gevormde cellen) zijn nog steeds erg ineffectief. Om een gen in een cel te brengen dat door mutatie is uitgeschakeld en het te dwingen een bepaald eiwit te produceren, moet je een aantal cellen uit het lichaam verwijderen, het DNA erin bewerken en het terug in het lichaam plaatsen. In principe is er hoop dat het op deze manier mogelijk zal zijn om ziekten zoals Duchenne spierdystrofie of cystische fibrose te bestrijden, wanneer het nodig is om de werkcapaciteit van een deel van de cellen te herstellen. Wat betreft de aanleg voor kanker, tot dusver staat de genomische editor machteloos. Als een mutant gen bij een persoon wordt gevonden, wordt het in alle cellen van het lichaam aangetroffen. Het is niet realistisch om ze allemaal te veranderen. En elke cel met een mutatie is een bron van gevaar.
Maar zelfs als CRISPR / Cas slechts enkele fundamentele vragen zal helpen beantwoorden en de behandeling van zeldzame genetische ziekten mogelijk maakt, zal het nog steeds een grote stap voorwaarts zijn voor de mensheid.
Tatiana Pichugina
