Monsters van weefsels van mummies onder de namen "Maria" en "Vavita" werden voor onderzoek vanuit Peru naar een Russisch laboratorium gestuurd. De aangeleverde monsters van biologische weefsels werden bestudeerd met behulp van scanning elektronenmicroscopie, Raman spectra, ICPE, de samenstelling van diatomeeënaarde (een stof op het huidoppervlak van mummies) werd onderzocht. Er werd ook een onderzoek uitgevoerd naar het DNA van de overgedragen weefsels.
Monstervoorbereiding
Weefselmonsters van 500 μg werden overgebracht in plastic buisjes en opgelost in 1 ml buffer (10 mM Tris-HCl pH = 10,5, 1 mM EDTA, 0,15 M NaCl). Aan de resulterende suspensies werd Na-dodecylsulfaat toegevoegd tot 0,5%, verwarmd tot +80 ° C en na 10 minuten werd proteïnase K (tot 500 μg / ml) gedurende 24 uur in een thermostaat (+55 ° C) geplaatst.
Deproteïnisatie werd uitgevoerd door middel van de fenolische methode: het toevoegen van fenol aan de suspensie in gelijk volume, daarna fenol: chloroform (1: 1), chloroform; na elke toevoeging werd constant geroerd op een hoekrotor en gecentrifugeerd bij 15.000 tpm, 10 minuten.
Aan het supersediment dat na de 3e centrifugatie werd verkregen, werd 1/10 deel van het volume van 1 M NaCl en 2,5 volumes tweemaal gedestilleerde ethylalcohol toegevoegd, en het werd een nacht bij -30 ° C in conische reageerbuizen bewaard - "Eppendorf". Centrifugeren werd uitgevoerd bij 15 duizend vol. min. binnen 10 minuten en ontving DNA "neergeslagen" in de vorm van een bruin neerslag. De DNA-pellet werd twee keer gewassen met 70% ethylalcohol en gedroogd bij kamertemperatuur (1 uur) en vervolgens opgelost in TE-buffer.
PCR werd uitgevoerd op een programmeerbare thermische cycler "My Cycler" ("Bio = Rad") met behulp van standaard oligoprimeren gesynthetiseerd door middel van de vaste fase methode bij de vereniging "Beagler" (St. Petersburg). Het reactiemengsel voor amplificatie met een volume van 25 μl omvatte: 15 nM van elke oligoprimer, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 bij +25 ° C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoethanol, 170 μg / ml BSA en een mengsel van vier basische dNTP's in een concentratie van elk 1,0 mM en thermostabiele DNA-polymerase Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Na denaturatie (10 min, 94 ° C) werden 35 amplificatiecycli uitgevoerd voor elk testsysteem: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Om de specificiteit te controleren, werden DNA-monsters met bekende genotypen voor de bestudeerde loci (markersystemen), evenals controlemonsters, in de reactie geïntroduceerd.met een mengsel van reagentia zonder DNA. Na amplificatie werd een kleurbuffer toegevoegd aan aliquots van het reactiemengsel (7 μl) en gescheiden door verticale elektroforese in 6% polyacrylamidegel (210x150x1 mm), gekleurd met ethidiumbromide en gefotografeerd onder ultraviolet licht. Om allelen te identificeren, werden allelische standaarden gebruikt die overeenkomen met deze loci ("ladders").
Promotie video:
DNA-analyse
Voor de studie hebben we de methode van exoomanalyse van menselijk DNA gebruikt op basis van sequencing met hoge doorvoer met verrijking door hybridisatie.
Techniek van exoomanalyse van menselijk DNA.
2 monsters werden geanalyseerd … Alle stadia van monstervoorbereiding vóór PCR werden uitgevoerd in cleanrooms. Monstervoorbereiding, DNA-extractie en amplificatie van individuele DNA-fragmenten werden in verschillende kamers uitgevoerd.
Specifieke adapters (KAPA Library Preparation Kit en SeqCap Adapter Kit; Roche) werden geligeerd aan de uiteinden van het genomische gefragmenteerde DNA (~ 5 ng), waarna een tweetraps selectie van fragmenten in het lengtebereik van 200-350 bp werd uitgevoerd met AMPureXP-parels (Beckman Coulter). … De resulterende fragmenten werden geamplificeerd met behulp van adapter-specifieke primers en gehybridiseerd met gebiotinyleerde specifieke probes (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) gedurende 28 uur bij 47 ° C. In één reactie werden twee DNA-monsters gecombineerd. Gebiotinyleerde probe-DNA-hybriden werden geïsoleerd en gezuiverd met aan streptovidine geconjugeerde magnetische deeltjes; een tweede amplificatie en kwalitatieve beoordeling van de resulterende DNA-bibliotheek werd uitgevoerd (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Om off-target amplificatiefragmenten en adapterdimeren te verwijderen, werd de DNA-bibliotheek opnieuw gezuiverd met behulp van magnetische deeltjes van AMPureXP Beads (Fig. 1). De uiteindelijke concentratie van de voorbereide bibliotheek werd geëvalueerd op een Quantus-instrument met behulp van een commerciële QuantiFluor® dsDNA System-kit (Promega). De resulterende DNA-bibliotheek werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van de stroomcel. De sequentiebepaling werd uitgevoerd op het Illumina-platform met behulp van een Standard Flow Cell en MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cycli). De resulterende DNA-bibliotheek werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van de stroomcel. De sequentiebepaling werd uitgevoerd op het Illumina-platform met behulp van een Standard Flow Cell en MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cycli). De resulterende DNA-bibliotheek werd geïmmobiliseerd op het oppervlak van de stroomcel. De sequentiebepaling werd uitgevoerd op het Illumina-platform met behulp van een Standard Flow Cell en MiSeq Reagent Kit v2 300 (2 × 150 cycli).
Figuur: 1
Algemene beoordeling van de kwaliteit van het gesequentieerde DNA
Voor de initiële kwaliteitsbeoordeling zijn standaardmethoden zoals FastQC en de Jellyfish- en KraTER-programma's gebruikt. De kwaliteitsbeoordeling toonde geen kwaliteitsproblemen met de gesequentieerde DNA-waarden voor beide monsters. Afbeeldingen worden niet weergegeven omdat ze niet informatief zijn.
Voor het eerste monster (verder M, grote mummie "Maria"), werd de sequentie van 113,4 miljoen metingen uitgevoerd, voor het tweede monster (verder W, kleine mummie "WaWita") werd de sequentie van 22,9 miljoen metingen bepaald.
De volgende stap was het opschonen van de sequenced reads uit verschillende technische sequenties die verdere analyse zouden verstoren. Hiervoor werd het Cookiecutter-programma gebruikt. Na het schoonmaken waren er respectievelijk 113,3 miljoen (99%) metingen en 22,8 miljoen (99%) metingen voor M en W.
Schatting van de hoeveelheid oud DNA en de scheiding ervan met modern
De standaardmethode voor het beoordelen van de aanwezigheid en hoeveelheid oud DNA is het schatten van het aantal door de tijd beschadigde nucleotiden. Hiervoor is het programma MapDamage 2.0 gebruikt. MapDamage 2.0 die de hoeveelheid oud DNA in 30,1% liet zien, maar aangezien MapDamage impliceert dat we een nauwe referentie gebruiken, en we niet precies weten hoe dicht beide monsters bij het genoom van de moderne mens zijn, en we gebruikten een exoombibliotheek, was deze methode op zichzelf niet voldoende. Een andere goede methode om oud DNA te beoordelen, is het aantal korte fragmenten.
De filtratie van het vermeende oude DNA vond plaats in drie fasen. In de eerste fase hebben we alle gepaarde reads verwijderd die niet kunnen worden gekruist en samengevoegd tot één ongepaarde read met een overlap. Deze uitlezingen gaven aan dat het oorspronkelijke fragment waarvan de sequentie werd bepaald langer was dan 300 bp. en hoogstwaarschijnlijk modern DNA. Dus na deze stap bleven respectievelijk 86,9% en 91,8% over. Daarna werden enkele overlappende fragmenten geselecteerd zodat hun lengte korter was dan 150 bp, aangezien dit de lengte is die we verwachtten voor oud DNA. Na deze stap bleven respectievelijk 8,6% en 38,5% over voor monsters M en W. Opgemerkt moet worden dat ondanks het verschil in percentage het absolute aantal uitlezingen tussen monsters M en W zeer vergelijkbaar is: 9,8M en 8,8M, wat kan worden verklaard door het feit dat de inhoud van oud DNA in beide monsters is vergelijkbaar.
| Parameter | Voorbeeld M (Maria) | Voorbeeld W (Wawita) |
| Aantal gelezen | 113,3 miljoen | 22,8 miljoen |
| Percentage korte fragmenten <300 bp | 86,9% | 91,8% |
|
Percentage korte fragmenten <150 bp (aantal) |
8,6% (9.846.035) |
38,5% (8813220) |
|
Percentage fragmenten uitgelijnd per menselijk genoom (aantal) |
2,03% (2.345.084) |
9,65% (2.264.551) |
| Percentage fragmenten uitgelijnd per menselijk genoom van kort <150 bp | 23,8% | 25,6% |
DNA verkrijgen dat lijkt op het referentie menselijke genoom
Het resulterende vermeende oude DNA werd in kaart gebracht op een menselijk referentiegenoom met behulp van een standaard zoekpijplijn voor genomische varianten met behulp van BWA, samtools en Wcftools.
Bovendien werden slechts 23,8% van monster M en 25,6% met succes in kaart gebracht op het referentiegenoom van moderne mensen. Tegelijkertijd kon voor beide monsters 75% van de sequentie-aflezingen niet in kaart worden gebracht op het menselijk genoom. Dit kan zowel verklaard worden door besmetting als door het feit dat deze monsters ver genoeg van het genoom van de moderne mens verwijderd zijn. Tegelijkertijd is het de moeite waard om in gedachten te houden dat we de exome-bibliotheek hebben gesequenced en daardoor de besmetting van bacterieel DNA tot een minimum hebben beperkt.
Uit de eerste verkenningsanalyse van ongekookte reads bleek dat sommige ervan behoorden tot repetitief DNA dat specifiek is voor hoefdieren, dit kan worden verklaard door het feit dat lama-vet werd gebruikt bij mummificatie.
Een meer gedetailleerde analyse vereist ongeveer drie weken van berekeningen, aangezien de bestaande oplossingen alleen worden gemaakt voor virale en bacteriële genomen, en we moeten vergelijken met alle bestaande genomen, inclusief plantengenomen, om te begrijpen van welke soorten de sequentie is bepaald.
Kenmerken van de gevonden opties
De in kaart gebrachte aflezingen werden gebruikt om te zoeken naar varianten die M- en W-monsters onderscheiden van het moderne menselijke genoom, en om de besmetting van aflezingen van het menselijke Y-chromosoom te beoordelen.
De eerste vraag die moest worden beantwoord, was aan welke chromosomen de sequentie-aflezingen waren toegewezen.
Omdat we weten dat Maria's monsters geïsoleerd waren uit botten en spieren, en Vavita alleen uit botten, verwachtten we een verschil in de hoeveelheid mtDNA. Maar er was niet veel verschil.
Het aantal in kaart gebrachte aflezingen op Y is een andere test voor besmetting door moderne mensen. Interessant genoeg bleek het in beide monsters hetzelfde te zijn.
De statistieken van de gevonden varianten worden hieronder weergegeven:
| Parameters | Voorbeeld M (Maria) | Voorbeeld W (Wawita) |
| Aantal gevonden opties | 79957 | 48941 |
| Aantal opties op Y | 534 | 541 |
| Het aantal betrouwbare opties (meer dan 20 keer gelezen en meer dan 30 kwaliteit) | 16969 | 6181 |
| Varianten met bekende rsid (beschikbaar in de snip-database) | 5701 | 3089 |
| Algemeen geldige opties | 92 | |
| gemeenschappelijke opties met rsid | 49 |
Daarna werd het mogelijk om de vraag te beantwoorden: zijn M en W familie? Het antwoord is nee.
Er werden slechts 49 overeenkomende varianten gevonden tussen M en W en 3040 die verschillen voor varianten met bekende rsid. Bovendien zijn dit misschien verschillende typen of ondersoorten van een persoon of een onbekend wezen.
Interessant is dat de varianten met het Y-chromosoom identiek zijn voor beide monsters, wat duidt op besmetting door dezelfde persoon, en dat er in het oude DNA van het Y-chromosoom waarschijnlijk nog geen chromosoom zit.
Evaluatie van de gelijkenis met de bestaande gesequentieerde menselijke genomen uit het 1000 Human Genome Project
Merk op dat dit slechts een geschatte analyse is, aangezien voor een nauwkeurigere analyse varianten nodig zijn uit regio's van het genoom onder neutrale selectie, en we hebben exoomgegevens.
Niettemin was het met 5708 varianten voor M of 3096 voor S mogelijk om een variant van de analyse uit te voeren vergeleken met de gegevens van 1000 menselijke genomen.
Het resultaat van de PCA-analyse in de onderstaande afbeelding is een overlay van twee afbeeldingen voor M en W, afzonderlijk berekend, aangezien er te weinig gemeenschappelijke opties zijn tussen M en W om de afstanden tussen M en W te schatten.
Gelijkenis score.
Zoals je kunt zien, is er geen toeval met een groep genen, ze verschillen ook van elkaar. Houd er echter rekening mee dat we coderende sequenties onder selectie hebben gebruikt, en het wordt aanbevolen om varianten onder neutrale selectie te gebruiken.
Desalniettemin is het PCA-resultaat in goede overeenstemming met handmatige verificatie van varianten, waaruit bleek dat de gegevens zich in een niet-gerefereerde homozygoot bevinden, wat opnieuw aangeeft dat de afbeeldingen ver verwijderd zijn van het moderne menselijke genoom.
Gevolgtrekking
Helaas waren we beperkt tot slechts twee monsters, meestal worden er bij dit type analyse meer gebruikt, tenminste 3-10 op de een of andere manier gerelateerd. Daarom is het noodzakelijk om het onderzoek voort te zetten met een groot aantal monsters.
Tegelijkertijd kunnen we hoogstwaarschijnlijk concluderen dat de DNA-monsters van Mary en Vavita overeenkomen met menselijk DNA, maar niet samenvallen met het DNA dat voor ons beschikbaar is uit een database van 1000 mensen.
Auteurs van het rapport: Baranov V. S. en Aseev M. V. (Wetenschappelijk onderzoeksinstituut voor verloskunde en gynaecologie, afdeling prenatale diagnostiek), Glotov A. S. en Glotov O. S. (St. Petersburg State University), A. S. Komissarov (Instituut voor Cytologie, Russische Academie van Wetenschappen, Centrum voor Genetische Bio-informatica).
Materiaal geleverd door Konstantin Georgievich Korotkov (doctor in de technische wetenschappen, professor aan de universiteit van informatietechnologie, mechanica en optica) en Dmitry Vladislavovich Galetsky (kandidaat voor medische wetenschappen, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
Voor meer informatie over Nazca-mummies, zie de tag: Nazca-mummies.
