Genetische manipulatie biedt de mensheid kansen om voorheen niet-bestaande organismen te creëren en genetische ziekten te vernietigen. De zaken zijn echter niet zo rooskleurig, aangezien zelfs de doorbraak CRISPR / Cas9-technologie verre van perfect is. De fouten die ze maakt, zijn misschien zeldzaam, maar één is genoeg om een persoon fataal te worden. Lenta.ru vertelt over wat er mis is met CRISPR en hoe wetenschappers proberen de situatie op te lossen.
Het CRISPR / Cas9-systeem - een soort DNA-schaar - wordt met recht beschouwd als een revolutie op het gebied van genetische manipulatie. Met zijn hulp kunnen wetenschappers het menselijk genoom bewerken, schadelijke mutaties eruit verwijderen en zo onaangename en dodelijke erfelijke ziekten behandelen. Men moet echter niet denken dat dergelijke methoden voorheen niet bestonden. In het arsenaal van genetici bevonden zich bijvoorbeeld nucleasen met zink "vingers" en endonucleasen - enzymen die DNA-moleculen op specifieke plaatsen afbreken. Qua nauwkeurigheid, veelzijdigheid en kosten zijn ze merkbaar inferieur aan CRISPR / Cas9, hoewel de laatste verre van perfect is.
CRISPR / Cas9 is oorspronkelijk niet gemaakt door wetenschappers, maar door de natuur. Het is een moleculair mechanisme dat in bacteriën voorkomt en waarmee ze bacteriofagen en andere parasieten kunnen bestrijden. In feite werkt het als een immuniteit tegen infectie. CRISPR (staat voor "korte palindrome herhalingen, regelmatig in groepen verdeeld") zijn speciale gebieden (loci) van DNA. Ze bevatten korte fragmenten van DNA-virussen die ooit de voorouders van de hedendaagse bacteriën infecteerden, maar werden verslagen door hun interne afweer. Deze stukken worden spacers genoemd en worden van elkaar gescheiden door herhalende reeksen.
Wanneer een bacteriofaag een bacterie binnendringt, worden elke herhalende sequentie en aangrenzende spacer gebruikt als een sjabloon voor de synthese van moleculen die crRNA's worden genoemd. Er worden veel verschillende RNA-ketens gevormd, die binden zich aan het Cas9-eiwit, wiens taak uiterst eenvoudig is: het DNA van het virus knippen. Hij zal dit echter alleen kunnen doen nadat crRNA een complementair fragment van viraal DNA heeft gevonden. Nadat Cas9 het vreemde nucleïnezuur heeft afgebroken, wordt het laatste volledig vernietigd door andere nucleasen.
CRISPR / Cas9 is juist goed vanwege de nauwkeurigheid, want voor bacteriën is het correct functioneren van het immuunsysteem een kwestie van leven en dood. Het "antivirus" -systeem moet een deel van het virale DNA tussen een miljoen andere vinden en, belangrijker nog, het niet verwarren met zijn eigen genoom. Gedurende miljoenen jaren van evolutie hebben bacteriën dit mechanisme geperfectioneerd. Dus toen ze erachter kwamen waarom een CRISPR-systeem nodig was, realiseerden ze zich dat het kon worden getemd als een ongekend nauwkeurig hulpmiddel voor het bewerken van genen.
Om de ene specifieke regio in het genoom te vervangen door een andere, is het nodig om gids-RNA te synthetiseren, dat in principe vergelijkbaar is met crRNA. Ze vertelt Cas9 waar het nodig is om een dubbelstrengs breuk te maken in het DNA van het gemodificeerde organisme. We hoeven het gen echter niet te bederven, maar het te modificeren - bijvoorbeeld door een of meer nucleotiden te vervangen en de schadelijke mutatie te verwijderen. Hier komt de natuur weer te hulp. Natuurlijke reparatiemechanismen beginnen onmiddellijk de doorgesneden ketting te herstellen. De truc is dat hiervoor bij de breuk enkele RNA-fragmenten worden verwijderd, waarna daar vergelijkbare sequenties worden ingebracht. Wetenschappers kunnen ze vervangen door hun eigen DNA-sequenties en zo het genoom wijzigen.
Schematische weergave van CRISPR
Promotie video:
Afbeelding: Kaidor / Wikipedia
Niets is echter perfect. Ondanks zijn relatieve nauwkeurigheid maakt CRISPR soms fouten. Een van de redenen ligt in de aard van het systeem. Het is nadelig voor bacteriën dat crRNA voor 100 procent samenvalt met een fragment van viraal DNA, dat één of twee nucleotiden kan verschillen. Het is voor haar beter dat sommige nucleotiden anders kunnen zijn, waardoor het micro-organisme een betere kans heeft om de infectie te bestrijden. Tegelijkertijd dreigt bij genetische manipulatie lage specificiteit met fouten: veranderingen kunnen op de verkeerde plaats worden aangebracht. Als dit gebeurt tijdens experimenten met muizen, dan zal er geen bijzondere tragedie zijn, maar het bewerken van het menselijk genoom kan een ramp worden.
Dit verklaart de bezorgdheid van westerse wetenschappers over de experimenten die in China worden uitgevoerd. Aziatische onderzoekers hebben CRISPR-technologie gebruikt om menselijke embryo's genetisch te modificeren. Dergelijke experimenten zijn verboden in Europa en de Verenigde Staten, maar onlangs heeft het VK ze toegestaan - uitsluitend voor onderzoeksdoeleinden. Dergelijke embryo's zullen binnen een paar weken na ontvangst vernietigd moeten worden, hetgeen het "fokken" van gg-mensen uitsluit.
CRISPR / Cas9 zou echter niet zo geweldig zijn als het niet kon worden verbeterd. Wetenschappers leerden Cas9 dus om niet twee kettingen tegelijk door te snijden, maar slechts één. De snede wordt gemaakt op twee verschillende plaatsen in de DNA-sequentie op verschillende strengen, dus het systeem moet in staat zijn om twee keer zoveel nucleotiden te herkennen als normaal, waardoor het nauwkeuriger wordt.
Eiwit Cas en crRNA
Foto: Thomas Splettstoesser / Wikipedia
Wetenschappers van de University of Western Ontario hebben een andere manier gevonden om deze technologie te verbeteren. Ze probeerden het probleem van het repareren van het geknipte DNA op te lossen. Het snelle herstel van de nucleïnezuurketen leidt ertoe dat wetenschappers geen tijd hebben om hun eigen correcties aan het genoom aan te brengen. Zo ontstaat er een vicieuze cirkel: de ketting, op een ongewenste manier gerepareerd, moet weer doorgeknipt worden met het Cas9-eiwit.
Om dit te voorkomen, hebben de onderzoekers de eiwitschaar aangepast om het TevCas9-eiwit te maken. Het snijdt de DNA-streng op twee plaatsen, waardoor het moeilijk is om de site te repareren. Voor de synthese van een nieuw enzym werd het enzym I-Tevl toegevoegd aan Cas 9, dat ook een endonuclease is, dat wil zeggen een eiwit dat een DNA-molecuul in het midden splitst in plaats van de uiteinden van de sequentie af te splitsen, zoals exonucleasen doen. Het resulterende fusie-eiwit bleek nauwkeuriger te binden aan specifieke sites en maakte minder snel een fout en sneed de verkeerde site af.
Kristalstructuur van Cas9 gebonden aan DNA
Foto: Cas9 wiki-project / Wikipedia
Er is een andere manier om de nauwkeurigheid van CRISPR-systemen te verbeteren. De "wapenwedloop" tussen bacteriën en virussen heeft niet alleen geleid tot de ontwikkeling van verdedigingssystemen in micro-organismen, maar ook tot manieren om deze te neutraliseren. Bacteriofagen muteren dus snel en verliezen de gebieden waardoor bacteriële immuniteit ze herkent. Sommige coderen echter voor anti-CRISPR-eiwitten, die het werk van het crRNA-Cas9-complex verstoren.
Op 8 december publiceerde het tijdschrift Cell een artikel van wetenschappers van de Universiteit van Toronto die "anti-CRISPR" creëerden - een systeem waarmee je het mechanisme onder bepaalde voorwaarden kunt uitschakelen. Het voorkomt ongewenste fouten door Cas9-activiteit te onderdrukken in het geval dat het gids-RNA aan het verkeerde fragment bindt. Anti-CRISPR bestaat uit drie eiwitten die nuclease remmen en worden gecodeerd door de genen van een van de bacteriële virussen.
CRISPR-technologie wordt al gebruikt om ernstige ziekten zoals leukemie en longkanker te behandelen, en wordt ook getest om immuuncellen van HIV te reinigen. Naarmate wetenschappers nieuwe manieren vinden om deze methode te verbeteren, zullen er steeds meer mogelijkheden voor de toepassing ervan ontstaan.
Alexander Enikeev
