Een internationaal team van wetenschappers uit de Verenigde Staten, Frankrijk en China heeft een semi-synthetische levensvorm gecreëerd. Hoewel er al pogingen zijn ondernomen om bacteriën met gemodificeerd DNA te verkrijgen, vermenigvuldigden micro-organismen zich slecht, vereisten ze speciale groeiomstandigheden en raakten ze uiteindelijk de modificaties kwijt die erin waren aangebracht. "Lenta.ru" vertelt over een nieuw werk waarin de onderzoekers erin slaagden deze problemen op te lossen, nadat ze een wezen hadden verkregen dat radicaal verschilt van al het natuurlijke leven op aarde.
Nog niet zo lang geleden bestond het DNA van alle levende organismen op onze planeet uit vier soorten nucleotiden die adenine (A), of thymine (T), of guanine (G), of cytosine © bevatten. Strengen van tientallen of honderden miljoenen nucleotiden vormen afzonderlijke chromosomen. De genen die op chromosomen worden gevonden, zijn in wezen lange nucleotidesequenties waarin de aminozuursequenties van eiwitten zijn gecodeerd. De combinatie van drie opeenvolgende nucleotiden (codon of triplet) komt overeen met een van de 20 aminozuren. Het leven gebruikt dus een genetische code van drie letters (ATG, CGC, enzovoort) op basis van een alfabet van vier letters (A, C, T, G).
Wanneer een cel van een organisme een eiwit (polypeptide) nodig heeft, wordt het gen dat daarvoor codeert aangezet. Dit laatste is gehecht aan een speciaal enzym genaamd RNA-polymerase, dat tijdens het transcriptieproces de sequentie van nucleotiden begint te volgen en er een kopie van maakt in de vorm van een molecuul genaamd messenger RNA (mRNA). RNA lijkt erg op DNA, maar in plaats van thymine bevat het uracil (U). Daarna verlaat het mRNA de celkern en wordt het naar de ribosomen geleid, waar het tijdens het translatieproces dient als recept voor het creëren van de aminozuurketen van het eiwit.
De onderzoekers besloten de genetische code van Escherichia coli te veranderen door er twee extra "letters" aan toe te voegen. Het feit is dat DNA in levende organismen dubbel is, dat wil zeggen dat het wordt gevormd door twee ketens die met elkaar zijn gepaard door complementaire bindingen. Dergelijke bindingen worden gevormd tussen de basis van de A-nucleotide van de ene streng en de basis van de T-nucleotide van de andere (op dezelfde manier tussen C en G). Daarom moeten de twee nieuwe synthetische nucleotiden ook complementair kunnen paren. De keuze viel op dNaM en d5SICS.
E. coli Escherichia coli
Foto: Rocky Mountain Laboratories / NIAID / NIH
Een paar synthetische nucleotiden werd ingebracht in een plasmide - een dubbelstrengs circulair DNA-molecuul dat zich afzonderlijk van de rest van het bacteriële genoom kan vermenigvuldigen. Ze vervingen een paar complementaire nucleotiden A en T, die deel uitmaakten van het lactose-operon - een reeks genen die lactosesuiker metaboliseren, en bijbehorende niet-coderende DNA-sequenties. Synthetische nucleotiden waren niet opgenomen in het gebied dat de polymerase in mRNA kopieert.
Promotie video:
Waarom hebben wetenschappers besloten om synthetische nucleotiden niet rechtstreeks in het gen in te brengen, maar ernaast? Het is een feit dat het erg moeilijk is om een gen op deze manier te veranderen zodat het functioneel blijft. Hiervoor moet je immers de resulterende nieuwe codons aan elk aminozuur binden. Hiervoor is het op zijn beurt nodig om de cel te leren verschillende soorten transport-RNA (tRNA) te produceren, die deze codons kunnen herkennen.
De tRNA-moleculen vervullen de volgende functie. Ze dragen, net als vrachtwagens, aan het ene uiteinde een bepaald aminozuur, naderen het mRNA in de ribosomen en beginnen op hun beurt het triplet van nucleotiden aan het andere uiteinde te matchen met het codon. Als ze overeenkomen, wordt het aminozuur verwijderd en in het eiwit opgenomen. Als er echter geen geschikt tRNA is, wordt het eiwit niet gesynthetiseerd, wat de levensvatbaarheid van de cel negatief kan beïnvloeden. Daarom zouden wetenschappers, door synthetische nucleotiden in genen te introduceren, genen moeten creëren die coderen voor nieuwe tRNA's die kunstmatige codons kunnen herkennen en het juiste aminozuur aan het polypeptide kunnen hechten. De taak van de onderzoekers was echter eenvoudiger. Ze moesten ervoor zorgen dat het plasmide met synthetische nucleotiden zich met succes zou vermenigvuldigen en aan dochterorganismen zou worden doorgegeven.
Plasmiden die werden gebruikt om Escherichia coli te transformeren
Afbeelding: Denis A. Malyshev / Kirandeep Dhami / Thomas Lavergne / Tingjian Chen / Nan Dai / Jeremy M. Foster / Ivan R. Correa / Floyd E. Romesberg / Nature / Department of Chemistry / The Scripps Research Institute
Dit plasmide, pINF genoemd, werd in E. coli geïntroduceerd. Om het te kopiëren, is het echter nodig dat er veel nucleotiden in de bacteriecel aanwezig zijn. Voor dit doel werd een ander plasmide, pCDF-1b, in E. coli geïnsereerd. Het bevatte het gen voor de diatomee Phaeodactylum tricornutum PtNTT2, dat codeert voor het NTT-eiwit, dat nucleotiden van het voedingsmedium naar de cel transporteert.
Wetenschappers werden echter geconfronteerd met een aantal moeilijkheden. Ten eerste hebben de eiwitten van Phaeodactylum tricornutum een toxisch effect op de E. coli-cel. Allemaal vanwege de aanwezigheid in hen van een fragment van de aminozuursequentie, dat een signaalfunctie heeft. Dankzij haar neemt het eiwit de juiste positie in de algencel in, waarna de sequentie wordt verwijderd. E. coli kan dit fragment niet verwijderen, dus de onderzoekers hebben haar geholpen. Ze waren in staat om de eerste 65 aminozuren uit NTT te verwijderen. Dit verminderde de toxiciteit aanzienlijk, hoewel het ook de snelheid van nucleotidetransport verminderde.
Een ander probleem was dat synthetische nucleotiden lange tijd in plasmiden werden vastgehouden en niet werden vervangen wanneer DNA werd gekopieerd. Het bleek dat hun veiligheid afhing van de nucleotiden die hen omringden. Om daar achter te komen, analyseerden de wetenschappers verschillende combinaties die in 16 plasmiden waren ingebed. Om te begrijpen of een synthetisch nucleotide uit de sequentie was gevallen, gebruikten de onderzoekers CRISPR / Cas9-technologie.
CRISPR / Cas9
Afbeelding: Steve Dixon / Feng Zhang / MIT
CRISPR / Cas9 is een moleculair mechanisme dat in bacteriën voorkomt en waarmee ze bacteriofagen kunnen bestrijden. Met andere woorden, deze technologie staat voor immuniteit tegen virale infecties. CRISPR is een bijzonder stukje DNA. Ze bevatten korte fragmenten van DNA-virussen die ooit de voorouders van de hedendaagse bacteriën infecteerden, maar werden verslagen door hun interne afweer.
Wanneer de bacteriofaag de bacteriën binnendringt, worden deze fragmenten gebruikt als sjabloon voor de synthese van moleculen genaamd crRNA. Er worden veel verschillende RNA-ketens gevormd, deze binden zich aan het Cas9-eiwit, wiens taak het is om het DNA van het virus te knippen. Hij kan dit alleen doen nadat crRNA een complementair fragment van viraal DNA heeft gevonden.
Als in plaats van crRNA een RNA-sequentie wordt gebruikt die complementair is aan een bepaald fragment van het plasmide, dan zal Cas9 het plasmide ook knippen. Maar als er synthetische nucleotiden in dat fragment zitten, werkt het eiwit niet. Met CRISPR is het dus mogelijk om die plasmiden te isoleren die resistent zijn tegen ongewenste mutaties. Het bleek dat in 13 van de 16 plasmiden het verlies van synthetische nucleotiden onbeduidend was.
Zo slaagden de onderzoekers erin om een organisme te creëren met fundamentele veranderingen in het DNA, dat ze voor onbepaalde tijd in zichzelf kan vasthouden.
Hoewel een semi-synthetische levensvorm slechts twee onnatuurlijke nucleotiden in zijn genoom heeft, die niet in codons voorkomen en niet betrokken zijn bij de codering van aminozuren, is het het eerste resistente organisme waarvan het DNA-alfabet uit zes letters bestaat. In de toekomst zullen wetenschappers deze innovatie hoogstwaarschijnlijk kunnen gebruiken om eiwitten te synthetiseren en zo een volwaardige kunstmatige genetische code te creëren.
Alexander Enikeev
